§ 39. Сучасні методи генетики

Класичні методи генетичних досліджень, описані в попередньому параграфі, не розглядають молекулярні механізми функціонування спадкового матеріалу. Тому ці методи можуть передбачити лише ймовірність появи деяких генетичних порушень. А чи виникла нова мутація та де — з їхньою допомогою визначити неможливо. Для цього потрібні зовсім інші методи — молекулярно-біологічні та цитогенетичні. Саме вони безпосередньо досліджують структуру й роботу генів на молекулярному та клітинному рівнях.

Із § 37 ми дізналися, що багато генетичних захворювань людини пов’язані з хромосомними аномаліями. У разі таких захворювань для з’ясування діагнозу потрібен аналіз каріотипу — каріотипування. Для цього здійснюють виділення хромосом з окремих клітин людини, їх фарбування й ідентифікацію. Під дією хімічних барвників хромосоми набувають смугастого забарвлення, при цьому кожна хромосома має свою унікальну послідовність смуг. Таке фарбування хромосом дає змогу розподілити їх за парами, а також виявити ті чи ті аномалії в їхній будові або кількості (рис. 37.6, Б; 37.7).

Дуже часто каріотипування використовують під час пренатальної діагностики. Її проводять до пологів з метою виявлення тих чи тих генетичних відхилень у зародка ще на стадії внутрішньоутробного розвитку. Для цього лікарі здійснюють забір клітин ембріона, а потім каріотипують їх. Самого ембріона під час процедури торкатися не можна, щоб не нашкодити його розвитку. Тому для аналізу беруть або клітини ембріональної частини плаценти, або навколоплідну рідину (рис. 39.1). Клітини плаценти мають каріотип ембріона, а до навколоплідної рідини потрапляє невеличка кількість клітин, що «відпали» від зародка. Перший метод складніший, але він доступний на більш ранніх стадіях вагітності порівняно з другим. А другий метод простіший у реалізації, однак вимагає додаткового часу для нарощування клітинної маси, потрібної для каріотипування.

Рис. 39.1. Методи отримання клітин зародка

А. Забір клітин плаценти. Б. Забір навколоплідної рідини.

1. Апарат ультразвукової діагностики. 2. Шприц. 3. Плацента. 4. Плід. 5. Навколоплідна рідина.

Каріотипування використовують не лише в генетиці людини. Так, його часто застосовують для ідентифікації так званих видів-двійників. Наприклад, багато видів малярійних комарів практично не відрізняються один від одного зовнішньо, але значно різняться будовою хромосом. Визначення таких видів має практичний інтерес, оскільки не всі види є переносниками малярійного плазмодія 1 .

Полімеразна ланцюгова реакція — спосіб «розмножити» ДНК

1983 року американський біохімік Кері Мулліс запропонував метод здійснення реплікації специфічної ділянки ДНК у пробірці — полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР). Перед реплікацією дволанцюгові молекули ДНК «розплітаються» під час нагрівання на одноланцюгові, а далі на них за допомогою термостабільної ДНК-полімерази синтезуються нові комплементарні ланцюги ДНК. У результаті 20-30 таких циклів розплітання-синтезу можна за короткий період (близько години) синтезувати мільйони копій з одного-єдиного фрагмента ДНК просто в пробірці (рис. 39.2).

ПЛР відкриває безліч можливостей. З одного боку, дослідник може отримати велику кількість копій ділянки ДНК, яка його цікавить, що полегшить йому роботу із цим фрагментом, наприклад, його секвенування (дивися далі). З другого боку, можна визначити, чи є шукана ділянка ДНК у пробі, що нас цікавить. Так, наприклад, можна здійснити ПЛР у такий спосіб, що відбуватиметься синтез лише ділянки ДНК, специфічної для збудника холери. Тоді синтез нових копій ДНК відбуватиметься, лише якщо в досліджуваній пробі є ДНК хвороботворної бактерії. Отож можна просто та швидко визначати наявність інфекцій у воді, крові чи клітинах.

Для виявлення точкових мутацій потрібне секвенування нуклеїнових кислот

Визначення генних мутацій, що викликають спадкові захворювання, складніше. Найочевидніший метод пошуку точкової мутації — це «прочитати» послідовність нуклеотидів у певному фрагменті, що, можливо, містить мутацію. Таке визначення послідовності нуклеотидів має назву секвенування нуклеїнових кислот. Перший метод секвенування запропонував англійський біохімік Фредерік Сенгер у 1977 році. Початково завданням секвенування було визначення послідовності генів, але досить швидко цей процес було автоматизовано та використано для визначення послідовностей повних геномів. У 2003 році було опубліковано повністю секвенований людський геном.

Рис. 39.2. Копіювання ДНК під час ПЛР

1. Новий ланцюг. 2. Після першого циклу (2 копії). 3. Після другого циклу (4 копії). 4. Після третього циклу (8 копій). 5. Після четвертого циклу (16 копій).

1 Річ у тім, що рід Малярійні комарі налічує понад 400 видів, але тільки деякі з них є переносниками малярії. Однак усіх комарів цього роду називають малярійними. А для епідеміологів важливо визначати саме небезпечні види комарів.

Рис. 39.3. Флуоресцентна гібридизація

А. Методика. Б. Хромосоми з фрагментами, що світяться, у інтерфазі (ліворуч) та метафазі (праворуч) клітинного циклу.

Нині розшифровано геноми кількох десятків тисяч організмів (докладніше у доповненні VIII). Знання повних послідовностей генів і геномів дає змогу пролити світло на особливості їхньої будови та функціонування. Крім того, порівнюючи геноми різних організмів між собою, можна краще зрозуміти історичні зв’язки між ними та механізми еволюційних перетворень у живій природі (про це йтиметься в § 44).

Для пошуку порушень хромосом використовують флуоресцентну гібридизацію

Сучаснішим і точнішим методом пошуку хромосомних порушень є флуоресцентна гібридизація. У цьому методі використовують одноланцюгові фрагменти ДНК, мічені флуоресцентним барвником 1 . Мічена ДНК має послідовність, що відповідає порушенню в структурі хромосоми (делеції, інверсії чи транслокації). Якщо послідовність міченої ДНК відповідає певному фрагменту ДНК клітини, то вони зв’язуються — гібридизуються. Далі під флуоресцентним мікроскопом за наявністю світіння фрагмента під певним освітленням можна визначити, чи відбулася гібридизація та чи є шуканий фрагмент у геномі клітини (рис. 39.3).

Рис. 39.4. Використання модифікованих вірусів для генної терапії спадкових захворювань

1. Цитоплазма. 2. Ядро. 3. Функціональний ген. 4. Вірус-носій. 5. Ендоцитоз вірусу-носія. 6. Вивільнення вірусу-носія з везикули. 7. Потрапляння функціонального гена до ядра.

Генна терапія — спроба позмагатися з природою

Однією з гілок генетичних технологій є генетична модифікація людини з метою лікування генетичних захворювань — генна терапія. Значна частина генних захворювань пов’язана з тим, що в людини відсутній функціональний алель певного гена. Таку проблему можна розв’язати, штучно вводячи в людські клітини робочий ген (рис. 39.4). Зазвичай генну терапію проводять шляхом інфікування людини видозміненим вірусом: замість своєї нуклеїнової кислоти він несе ген людини. Цей ген потрапляє в ядро клітини, вбудовується в геном і починає там працювати замість дефектного гена. Таким чином, вдалося використати зброю, спрямовану проти нас — механізми вірусної атаки — для лікування нас самих. На сьогодні генну терапію вже використовують для лікування деяких генетичних і ракових захворювань. Детальніше про генну терапію ви дізнаєтеся з § 62.

1 Флуоресценція — це здатність речовини випромінювати власне світло при освітленні. Так, флуоресцентні фарби чи тонік світяться при освітленні їх ультрафіолетом.

Знайдіть одну правильну відповідь

1. Для визначення синдрому Дауна найзручніше використовувати

• А каріотипування
• Б флуоресцентну гібридизацію
• В секвенування
• Г ПЛР
• Д схрещування

2. Для пренатального каріотипування беруть клітини

• А власне ембріона
• Б плаценти
• В матки
• Г оболонки навколоплідного міхура
• Д пуповини

3. Вірус, що містить людський ген замість своєї нуклеїнової кислоти,

• А переносить ген людини до клітини
• Б проникає до клітини у вигляді білка
• В використовується для каріотипування
• Г повністю руйнується в цитоплазмі одразу після проникнення в клітину
• Д постійно утворюється в ракових клітинах

4. У результаті генної терапії в геномі перебувають щонайменше два різні алелі одного гена. З них правильно функціонує

Сформулюйте відповідь кількома реченнями

5. Навіщо для флуоресцентної гібридизації використовують мікроскоп? У чому особливість роботи цього мікроскопа порівняно зі світловим?

6. Чому для ПЛР використовують термостабільну полімеразу?

7. Один зі способів визначення вірусу імунодефіциту людини — це ПЛР із пробою крові. Як за допомогою цього методу знаходять ВІЛ в аналізі крові?

8. Чому саме вірус обрано як засіб доставки цільових генів до клітин?

Знайди відповідь і наблизься до розуміння природи

9. Як здійснити ПЛР із РНК?

10. Чи обов’язково для генної терапії використовувати вірус як носій гена? Чи можна ввести потрібний ген іншими способами?

Дізнайся самостійно та розкажи іншим

11. Як метод ПЛР застосовують у медицині, криміналістиці та судовій практиці?

12. Як, порівнюючи нуклеотидні послідовності одного гена, можна дізнатися про еволюційну спорідненість організмів?

Молекулярно–генетичні методи діагностики

Специфічною ознакою спадкових хвороб є те, що їх причиною являються зміни ДНК. ДНК-діагностика, як технологія, яка направлена на виявлення причини хвороби, є більш адекватним, об’єктивним та інформативним методом у діагностики спадкової патології.

ДНК залишається практично не змінною протягом життя організму, починаючи з моменту запліднення яйцеклітини, що дозволяє проводити дослідження на любої стадії розвитку організму.

Молекулярно-генетичні методи – велика і різноманітна група методів, які призначені для виявлення ушкоджень у структурі ділянки ДНК (алеля, гена, регіону хромосоми) аж до розшифровки первинної послідовності основаній.

В основі цих методів лежать генно-інженерні маніпуляції з ДНК і РНК. Вихідним етапом усіх молекулярно-генетичних методів є одержання зразків ДНК. Джерелом геномной ДНК можуть бути будь-які клітини з ядром. На практиці частіше використовують лейкоцити, хоріон, амниотичні клітини, культури фібробластів. Можливість проведення молекулярно-генетичного аналізу з невеликою кількістю біологічного матеріалу є методичною перевагою методів даної групи.

У багатьох випадках для успішної діагностики хвороби досить досліджувати невеликий фрагмент генома. Виділення таких фрагментів стало можливим завдяки відкриттю ферментів – рестриктаз, що розрізають молекулу ДНК на фрагменти в строго визначених місцях.

Застосування цих ферментів в експерименті дає можливість одержати відносно короткі фрагменти ДНК, у яких легко можна визначити послідовність нуклеотидів.

Таким чином, за допомогою ДНК-діагностики можливо розв’язати наступні питання:

– підтвердження клінічного діагнозу чи диференційна діагностика у хворого;

– пре симптоматична діагностика – коли клінічні риси хвороби з пізньою маніфестацією відсутні;

– пренатальна діагностика по ДНК матеріалу від плоду (ворсини хоріону, клітини амніотичної рідини, кров плоду);

– преімплантаційна діагностика по ДНК клітин що дробляться у яйцеклітині, яка була запліднена in vitro.

Для клінічних цілей використовують аналіз ДНК людини, РНК, хромосом, білків, ферментів чи метаболітів для виявлення пов’язаннях з спадковою патологією генотипів, мутацій, фенотипів, чи каріотипів у клінічних цілях.

Розрізняють пряму і непряму ДНК-діагностику моногенных спадкових хвороб.

При прямій діагностиці предметом аналізу є мутації гена. У ДНК-діагностиці на теперішній час використовуються різноманітні прямі методи. Найбільше просто виявляються мутації, що змінюють довжину ампліфікованих фрагментів ДНК, що виявляються при электрофоретичному аналізі.

Для виявлення точкових мутацій, невеликих делецій і інверсій у досліджуваних генах використовують методи, за допомогою яких можна проаналізувати унікальну послідовність ДНК. Прикладом може служити метод секвенування – визначення нуклеотидної послідовності ДНК. Будь-які типи мутацій можуть бути виявлені шляхом прямого секвенування мутантної ДНК. Для деяких генів, що мають невеликі розміри, цей метод з успіхом застосовується як основний метод сканування мутацій. Головна перевага прямих методів діагностики – майже 100 % ефективність.

Непряме виявлення мутацій застосовується в тих випадках, коли нуклеотидна послідовність гена ще не відома, але мається представлення про положення гена на генетичній карті. Непряма ДНК-діагностика зводиться до аналізу поліморфних генетичних маркерів у хворих і здорових членів родини.

Маркери повинні бути розташовані у тому хромосомному регіоні, де і ген хвороби. Такими маркерами можуть бути ділянки ДНК, що існують у популяції в декількох алельних варіантах. Відмінності можуть бути по складу нуклеотидів, по числу дінуклеотидніх повторів. На основі варіабельністі маркерних ділянок ДНК можна диференціювати материнське чи батьківське походження конкретного варіанта маркера, якій зчеплен з геном хвороби.

Завдяки аналізу поліморфних генетичних маркерів можна визначити і простежити в поколіннях хромосому, що несе патологічний ген. Технічні прийоми до непрямій діагностиці ті ж, що й у прямій діагностиці (одержання ДНК, єлектрофорез і інші). Головний недолік непрямих методів діагностики – обов’язкове попереднє вивчення генотипу як мінімум одного ураженого родича.

На теперішній час активно розробляються діагностичні методики та окремі компоненти тест-систем для ДНК- аналізу мутантних генів, що спричинюють розвиток найбільш поширених в Україні моногенних спадкових захворювань (муковісцидоз, фенілкетонурія, спінальна м’язова атрофія, м’язова дистрофія Дюшена, синдром ламкої Х-хромосоми, гемофілія А, хорея Гентінгтона, спадковий гемохроматоз, мотосенсорна нейропатія Шарко-Марі-Тута, макулодістрофія Штаргардта), спадкову схильність до масових патологій (онкологічних, сердцево-судинних, ендокринних) та генетично обумовлені форми чоловічого (азооспермія, олігоспермія) і жіночого (передчасне виснаження яєчників) безпліддя.

Молекулярна діагностика можлива для наступних хвороб: