2.3: Інструменти мікроскопії

Ранні піонери мікроскопії відкрили вікно в невидимий світ мікроорганізмів. Але мікроскопія продовжувала просуватися в наступні століття. У 1830 році Джозеф Джексон Лістер створив по суті сучасний світловий мікроскоп. У 20 столітті відбувся розвиток мікроскопів, які використовували невидиме світло, такі як флуоресцентна мікроскопія, яка використовує ультрафіолетове джерело світла, та електронна мікроскопія, яка використовує короткохвильові електронні пучки. Ці досягнення призвели до значних покращень у збільшенні, роздільній здатності та контрасті. Для порівняння, відносно рудиментарні мікроскопи ван Леувенгука і його сучасників були набагато менш потужними, ніж навіть самі основні мікроскопи, що використовуються сьогодні. У цьому розділі ми розглянемо широкий спектр сучасних мікроскопічних технологій та загальних застосувань для кожного типу мікроскопа.

світлова мікроскопія

Багато типів мікроскопів підпадають під категорію світлових мікроскопів, які використовують світло для візуалізації зображень. Приклади світлових мікроскопів включають мікроскопи яскравого поля, мікроскопи темного поля, мікроскопи з фазовим контрастом, диференціальні інтерференційні контрастні мікроскопи, флуоресцентні мікроскопи, конфокальні скануючі лазерні мікроскопи та двофотонні мікроскопи. Ці різні типи світлових мікроскопів можуть бути використані для доповнення один одного в діагностиці та дослідженнях.

Мікроскопи Брайтфілд

Мікроскоп brightfield, мабуть, найбільш часто використовуваний тип мікроскопа, являє собою складний мікроскоп з двома або більше лінзами, які виробляють темне зображення на яскравому тлі. Деякі мікроскопи яскравого поля є монокулярними (мають один окуляр), хоча більшість новіших мікроскопів brightfield є бінокулярними (мають два окуляри), як показано на малюнку \(\PageIndex\) ; в будь-якому випадку кожен окуляр містить лінзу, яка називається очна лінза. Очні лінзи зазвичай збільшують зображення 10 разів (10). На іншому кінці тулуба знаходяться набір об’єктивних лінз на обертовому носі. Збільшення цих об’єктивів зазвичай коливається від 4до 100, зі збільшенням для кожного об’єктива, призначеного на металевому корпусі лінзи. Очні та лінзи об’єктива працюють разом, щоб створити збільшене зображення. Загальне збільшення – це продукт збільшення очей, що разів перевищує об’єктивне збільшення:

Наприклад, якщо обрана лінза \(40 \times\) об’єктиву і очна лінза \(10\times\) , загальне збільшення буде

Малюнок \(\PageIndex\) : Компоненти типового світлового мікроскопа.

Компоненти типового світлового мікроскопа.

Розглядається предмет називається зразком. Зразок поміщається на скляну гірку, яка потім обрізається на місце на сцені (платформі) мікроскопа. Після того, як слайд закріплений, зразок на слайді розміщується над світлом за допомогою механічних ручок ступеня xy. Ці ручки переміщують гірку по поверхні сцени, але не піднімають і не опускають сцену. Після того, як зразок зосереджений над світлом, положення сцени можна підняти або опустити, щоб сфокусувати зображення. Ручка грубого фокусування використовується для великомасштабних рухів з об’єктивами 4та 10; тонка ручка фокусування використовується для дрібномасштабних рухів, особливо з об’єктивами 40або 100.

Коли зображення збільшуються, вони стають тьмянішими, оскільки на одиницю площі зображення менше світла. Значно збільшені зображення, отримані мікроскопами, тому вимагають інтенсивного освітлення. У мікроскопі яскравого поля це світло забезпечується освітлювачем, який, як правило, є лампочкою високої інтенсивності нижче сцени. Світло від освітлювача проходить вгору через конденсаторну лінзу (розташовану нижче сцени), яка фокусує всі світлові промені на зразку для максимального освітлення. Положення конденсатора можна оптимізувати за допомогою приєднаної ручки фокусування конденсатора; після встановлення оптимальної відстані конденсатор не слід переміщати для регулювання яскравості. Якщо потрібні менш ніж максимальні рівні освітленості, кількість світла, що вражає зразок, можна легко регулювати, відкривши або закривши діафрагму між конденсатором та зразком. У деяких випадках яскравість також можна регулювати за допомогою реостата – перемикача диммера, який контролює інтенсивність освітлювача.

Яскраво-польовий мікроскоп створює зображення, направляючи світло від освітлювача на зразок; це світло диференційно передається, поглинається, відбивається або заломлюється різними структурами. Різні кольори можуть поводитися по-різному, коли вони взаємодіють зхромофорами (пігментами, які поглинають і відбивають певні довжини хвиль світла) в частинок зразка. Часто хромофори штучно додають до зразка за допомогою плям, які служать для підвищення контрастності та роздільної здатності. В цілому структури в екземплярі будуть здаватися темнішими, в різній мірі, ніж яскравий фон, створюючи максимально різкі зображення при збільшеннях приблизно до 1000. Подальше збільшення створило б зображення більшого розміру, але без збільшеної роздільної здатності. Це дозволяє нам бачити об’єкти, такі маленькі, як бактерії, які видно приблизно при 400 або близько того, але не менші об’єкти, такі як віруси.

При дуже великих збільшеннях роздільна здатність може бути порушена, коли світло проходить через невелику кількість повітря між зразком і лінзою. Це пов’язано з великою різницею між показниками заломлення повітря і скла; повітря розсіює світлові промені, перш ніж вони зможуть бути сфокусовані лінзою. Для вирішення цієї проблеми можна використовувати краплю масла для заповнення простору між зразком і масляною занурювальною лінзою, спеціальною лінзою, призначеною для використання з іммерсійними маслами. Оскільки масло має показник заломлення, дуже схожий на показник скла, воно збільшує максимальний кут, під яким світло, що виходить із зразка, може вдарити об лінзу. Це збільшує зібране світло і, таким чином, роздільну здатність зображення (рис. \(\PageIndex\) ). Різноманітні масла можна використовувати для різних типів світла.

Малюнок \(\PageIndex\) : (а) Масляні занурення лінзи, подібні до цього, використовуються для поліпшення роздільної здатності. (б) Оскільки іммерсійне масло та скло мають дуже схожі показники заломлення, перед тим, як світло досягне лінзи, існує мінімальна кількість заломлення. Без занурення масла світло розсіюється, коли воно проходить через повітря над слайдом, погіршуючи роздільну здатність зображення.

Технічне обслуговування мікроскопа: Кращі практики

Навіть дуже потужний мікроскоп не може доставити зображення з високою роздільною здатністю, якщо він не очищений і не підтримується належним чином. Оскільки лінзи ретельно розроблені та виготовлені для заломлення світла з високим ступенем точності, навіть злегка брудна або подряпана лінза буде ненавмисно заломлювати світло, погіршуючи зображення зразка. Крім того, мікроскопи є досить делікатними інструментами, і необхідно дотримуватися великої обережності, щоб уникнути пошкодження деталей і поверхонь. Крім усього іншого, правильний догляд за мікроскопом включає в себе наступне:

• очищення лінз папером для лінз
• не дозволяючи лінзам контактувати з слайдом (наприклад, шляхом швидкої зміни фокусу)
• захист колби (якщо вона є) від поломки
• не штовхаючи мета в слайд
• не використовуючи ручку грубого фокусування при використанні об’єктивів 40або більше
• лише використовуючи іммерсійне масло зі спеціалізованою олійною метою, як правило, об’єктом 100
• очищення масла від іммерсійних лінз після використання мікроскопа
• очищення будь-якого масла, випадково перенесеного з інших лінз
• покриття мікроскопа або розміщення його в шафі, коли він не використовується

Мікроскопія темного поля

Мікроскоп темного поля – це яскравопольовий мікроскоп, який має невелику, але значну модифікацію конденсатора. Між освітлювачем і лінзою конденсатора поміщається невеликий непрозорий диск (близько 1 см в діаметрі). Цей непрозорий світловий стоп, як називається диск, блокує більшу частину світла від освітлювача, коли він проходить через конденсатор на шляху до об’єктива, виробляючи порожнистий конус світла, який зосереджений на зразку. Єдине світло, яке досягає мети, – це світло, яке було заломлено або відбито структурами в зразку. Отримане зображення зазвичай показує яскраві об’єкти на темному тлі (рис. \(\PageIndex\) )

Малюнок \(\PageIndex\) : Непрозорий світловий стоп, вставлений у мікроскоп яскравого поля, використовується для отримання зображення темного поля. Зупинка світла блокує світло, що рухається безпосередньо від освітлювача до об’єктива, дозволяючи лише відбитому або заломленому світлу від зразка потрапляти до ока.

Непрозорий світловий стоп, вставлений в мікроскоп brightfield, використовується для отримання зображення темного поля. Зупинка світла блокує світло, що рухається безпосередньо від освітлювача до об’єктива, дозволяючи лише відбитому або заломленому світлу від зразка потрапляти до ока.

Мікроскопія темного поля часто може створювати висококонтрастні зображення зразків з високою роздільною здатністю без використання плям, що особливо корисно для перегляду живих зразків, які можуть бути вбиті або іншим чином скомпрометовані плямами. Наприклад, тонкі спірохети на кшталт Treponema pallidum, збудника сифілісу, найкраще можна розглянути за допомогою мікроскопа темного поля (рис. \(\PageIndex\) ).

Малюнок \(\PageIndex\) : Використання мікроскопа темного поля дозволяє переглядати живі, незаплямовані зразки спірохети Treponema pallidum. Схожі на фотографічний негатив, спірохети виглядають яскраво на темному тлі. (кредит: Центри контролю та профілактики захворювань)

Використання мікроскопа темного поля дозволяє переглядати живі, незаплямовані зразки спірохети Treponema pallidum. Схожі на фотографічний негатив, спірохети виглядають яскраво на темному тлі. (кредит: Центри контролю та профілактики захворювань/Хаббард Хаббард)

Визначте ключові відмінності між яскравим полем та мікроскопією темного поля.

Клінічна спрямованість: Частина 2

Ранові інфекції, такі як Сінді, можуть бути викликані багатьма різними типами бактерій, деякі з яких можуть швидко поширюватися з серйозними ускладненнями. Виявлення конкретної причини дуже важливо для вибору ліків, які можуть вбити або зупинити ріст бактерій.

Після виклику місцевого лікаря з приводу справи Сінді табірна медсестра відправляє зразок з рани в найближчу медичну лабораторію. На жаль, оскільки табір знаходиться у віддаленому районі, найближча лабораторія невелика і погано обладнана. Більш сучасна лабораторія, швидше за все, використовуватиме інші методи для культури, вирощування та ідентифікації бактерій, але в цьому випадку технік вирішує зробити мокре кріплення зі зразка та переглянути його під мікроскопом яскравого поля. У мокрому кріпленні до гірки додається невелика крапля води, а поверх зразка розміщується ковзання кришки, щоб утримувати його на місці перед тим, як він буде розміщений під об’єктивом.

Під мікроскопом brightfield технік ледве бачить клітини бактерій, оскільки вони майже прозорі на яскравому тлі. Щоб збільшити контрастність, технік вставляє непрозору світлову зупинку над освітлювачем. Отримане зображення темного поля чітко показує, що клітини бактерій кулясті і згруповані в грона, як виноград.

• Чому важливо визначити форму і закономірності росту клітин в зразку?
• Які ще види мікроскопії можна ефективно використовувати для перегляду цього зразка?

Мікроскопи з фазовим контрастом

Мікроскопи з фазовим контрастом використовують заломлення та перешкоди, спричинені структурами в зразку, для створення висококонтрастних зображень з високою роздільною здатністю без фарбування. Це найстаріший і найпростіший тип мікроскопа, який створює зображення, змінюючи довжини хвиль світлових променів, що проходять через зразок. Для створення змінених шляхів довжини хвилі в конденсаторі використовується кільцевий упор. Кільцева зупинка виробляє порожнистий конус світла, який фокусується на зразку до досягнення об’єктива. Об’єктив містить фазову пластину, що містить фазове кільце. В результаті світло, що рухається безпосередньо від освітлювача, проходить через фазне кільце, в той час як світло, заломлене або відбите зразком, проходить через пластину. Це призводить до того, що хвилі, що проходять через кільце, становитимуть близько половини довжини хвилі поза фазою з тими, що проходять через пластину. Оскільки хвилі мають піки та западини, вони можуть складатися разом (якщо у фазі разом) або скасовувати один одного (якщо поза фазою). Коли довжини хвиль поза фазою, хвильові жолоби скасують піки хвиль, що називається руйнівними перешкодами. Структури, які заломлюють світло, тоді здаються темними на яскравому тлі тільки незаломленого світла. Більш загально структури, що відрізняються такими особливостями, як показник заломлення, будуть відрізнятися рівнями темряви (рис. \(\PageIndex\) ).

Малюнок \(\PageIndex\) : Ця діаграма мікроскопа з фазовим контрастом ілюструє фазові відмінності між світлом, що проходить через об’єкт, і фоном. Ці відмінності утворюються шляхом пропускання променів через різні частини фазової пластини. Світлові промені накладаються на площину зображення, створюючи контраст за рахунок їх перешкод.

Ця діаграма мікроскопа з фазовим контрастом ілюструє фазові відмінності між світлом, що проходить через об’єкт, і фоном. Ці відмінності утворюються шляхом пропускання променів через різні частини фазової пластини. Світлові промені накладаються на площину зображення, створюючи контраст за рахунок їх перешкод.

Оскільки він збільшує контраст, не вимагаючи плям, для спостереження за живими зразками часто використовується мікроскопія з фазовим контрастом. Певні структури, такі як органели в еукаріотичних клітині та ендоспори в прокаріотичних клітині, особливо добре візуалізуються за допомогою мікроскопії з фазовим контрастом (рис. \(\PageIndex\) ).

Малюнок \(\PageIndex\) : Цей малюнок порівнює зображення яскравого поля (зліва) з фазоконтрастним зображенням (праворуч) тих же незаплямованих простих плоскоклітинних епітеліальних клітин. Клітини знаходяться в центрі та правому нижньому куті кожної фотографії (нерегулярний елемент над клітинами – це клітинні уламки). Зверніть увагу, що незабарвлені осередки в світлому полі зображення майже непомітні на тлі, тоді як осередки в фазоконтрастному зображенні здаються світитися на тлі, виявляючи набагато більше деталей.

Ця цифра порівнює зображення яскравого поля (зліва) з фазоконтрастним зображенням (праворуч) тих же незаплямованих простих плоскоклітинних епітеліальних клітин. Клітини знаходяться в центрі та правому нижньому куті кожної фотографії (нерегулярний елемент над клітинами – це клітинні уламки). Зверніть увагу, що незабарвлені осередки в світлому полі зображення майже непомітні на тлі, тоді як осередки в фазоконтрастному зображенні здаються світитися на тлі, виявляючи набагато більше деталей. (кредит: «Ясно кефір» /Wikimedia Commons)

Диференціальні перешкоди контрастні мікроскопи

Мікроскопи з диференціальним інтерференційним контрастом (DIC) (також відомі як оптика Номарського) схожі на мікроскопи з фазовим контрастом тим, що вони використовують інтерференційні моделі для посилення контрасту між різними особливостями зразка. У ДВС-мікроскопі створюються два пучка світла, в яких різниться напрямок руху хвилі (поляризація). Після того, як промені проходять через простір зразка або зразка, вони рекомбінуються, і ефекти зразків спричиняють відмінності в інтерференційних схемах, що генеруються об’єднанням пучків. Це призводить до отримання висококонтрастних зображень живих організмів з тривимірним виглядом. Ці мікроскопи особливо корисні для розрізнення структур всередині живих, незаплямованих зразків. (Малюнок \(\PageIndex\) ).

Малюнок \(\PageIndex\) : ДВС-зображення Fonsecaea pedrosoi, вирощеного на модифікованому леонівському агарі. Цей гриб викликає хромобластомікоз – хронічну шкірну інфекцію, поширену в тропічному та субтропічному кліматі.

ДВС-зображення Fonsecaea pedrosoi, вирощеного на модифікованому леонівському агарі. Цей гриб викликає хромобластомікоз – хронічну шкірну інфекцію, поширену в тропічному та субтропічному кліматі.

Які переваги фазового контрасту та ДВС-мікроскопії?

Флуоресцентні мікроскопи

Флуоресцентний мікроскоп використовує флуоресцентні хромофори, звані флюорохромами, які здатні поглинати енергію від джерела світла, а потім випромінювати цю енергію як видиме світло. Флюорохроми включають природно флуоресцентні речовини (такі як хлорофіли), а також флуоресцентні плями, які додаються до зразка для створення контрасту. Барвники, такі як Техаський червоний і FITC, є прикладами фторохромів. Інші приклади включають барвники нуклеїнової кислоти 4′,6′-діамідіно-2-феніліндол (DAPI) та акридин помаранчевий.

Мікроскоп передає світло збудження, як правило, форму ЕМР з короткою довжиною хвилі, наприклад, ультрафіолетове або синє світло, до зразка; хромофори поглинають світло збудження і випромінюють видиме світло з більшими довжинами хвиль. Потім світло збудження фільтрується (частково тому, що ультрафіолетове світло шкідливо для очей), так що через очну лінзу проходить лише видиме світло. При цьому виходить зображення екземпляра в світлих тонах на темному тлі.

Флуоресцентні мікроскопи особливо корисні в клінічній мікробіології. Вони можуть бути використані для ідентифікації патогенів, пошуку певних видів у середовищі або для пошуку місць розташування певних молекул і структур всередині клітини. Також були розроблені підходи для відрізнення живих від мертвих клітин за допомогою флуоресцентної мікроскопії на основі того, чи беруть вони конкретні флюорохроми. Іноді кілька фторохромів використовуються на одному зразку, щоб показати різні структури або особливості.

Одним з найважливіших застосувань флуоресцентної мікроскопії є методика під назвою імунофлюоресценція, яка використовується для ідентифікації певних хвороботворних мікробів, спостерігаючи, чи зв’язуються з ними антитіла. (Антитіла – це білкові молекули, що виробляються імунною системою, які приєднуються до конкретних патогенів, щоб вбити або пригнічувати їх. Існує два підходи до цієї методики: прямий імунофлюоресцентний аналіз (DFA) та непрямий імунофлюоресцентний аналіз (IFA). У ДФА специфічні антитіла (наприклад, ті, які є мішенню вірусу сказу) забарвлюються флюорохромом. Якщо зразок містить цільовий збудник, можна спостерігати антитіла, що зв’язуються зі збудником під флуоресцентним мікроскопом. Це називається первинним плямою антитіл, оскільки забарвлені антитіла прикріплюються безпосередньо до збудника.

При ІФА вторинні антитіла забарвлюються флюорохромом, а не первинними антитілами. Вторинні антитіла не прикріплюються безпосередньо до збудника, але зв’язуються з первинними антитілами. Коли неокрашенние первинні антитіла зв’язуються зі збудником, флуоресцентні вторинні антитіла можуть спостерігатися зв’язування з первинними антитілами. Таким чином, вторинні антитіла приєднуються побічно до збудника. Оскільки множинні вторинні антитіла часто можуть приєднуватися до первинного антитіла, IFA збільшує кількість флуоресцентних антитіл, прикріплених до зразка, полегшуючи візуалізацію особливостей у зразку (рис. \(\PageIndex\) ).

Малюнок \(\PageIndex\) : (а) Пряме імунофлюоресцентне пляма використовується для візуалізації Neisseria gonorrhoeae, бактерії, яка викликає гонорею. (b) Непряме імунофлюоресцентне пляма використовується для візуалізації личинок Schistosoma mansoni, паразитичного хробака, який викликає шистосомоз, кишкове захворювання, поширене в тропіках. (c) При прямій імунофлюоресценції пляма поглинається первинним антитілом, яке зв’язується з антигеном. При непрямій імунофлюоресценції пляма абсорбується вторинним антитілом, яке зв’язується з первинним антитілом, яке, в свою чергу, зв’язується з антигеном. (кредит a: зміна роботи Центрів контролю та профілактики захворювань; кредит b: зміна роботи Центрів контролю та профілактики захворювань)

Чому флюорохроми повинні використовуватися для дослідження зразка під флуоресцентним мікроскопом?

Конфокальні мікроскопи

Тоді як інші форми світлової мікроскопії створюють зображення, максимально сфокусоване на одній відстані від спостерігача (глибина або z-площина), конфокальний мікроскоп використовує лазер для послідовного сканування декількох Z-площин. Це дає численні двовимірні зображення з високою роздільною здатністю на різній глибині, які можуть бути побудовані в тривимірне зображення комп’ютером. Як і у випадку з флуоресцентними мікроскопами, флуоресцентні плями зазвичай використовуються для збільшення контрастності та роздільної здатності. Чіткість зображення додатково підвищується за рахунок вузької діафрагми, яка виключає будь-яке світло, яке не знаходиться з z-площини. Таким чином, конфокальні мікроскопи дуже корисні для дослідження товстих зразків, таких як біоплівки, які можна досліджувати живими та нефіксованими (рис. \(\PageIndex\) ).

Малюнок \(\PageIndex\) : Конфокальна мікроскопія може бути використана для візуалізації таких структур, як ця біоплівка ціанобактерій, що мешкає на даху. (кредит: модифікація роботи Американського товариства мікробіології).

Двофотонні мікроскопи

В даний час використання двофотонних мікроскопів обмежується передовими клінічними та дослідницькими лабораторіями через високу вартість приладів. Один двофотонний мікроскоп зазвичай коштує від 300 000 до 500 000 доларів, а лазери, що використовуються для збудження барвників, що використовуються на зразках, також дуже дорогі. Однак у міру вдосконалення технології двофотонні мікроскопи можуть стати більш доступними в клінічних умовах.

Які типи зразків найкраще досліджувати за допомогою конфокальної або двофотонної мікроскопії?

Електронна мікроскопія

Максимальна теоретична роздільна здатність зображень, створених світловими мікроскопами, в кінцевому підсумку обмежується довжинами хвиль видимого світла. Більшість світлових мікроскопів можуть збільшувати лише 1000, а деякі можуть збільшувати до 1500, але це не починає наближатися до збільшувальної потужності електронного мікроскопа (ЕМ), який використовує короткохвильові електронні пучки, а не світло для збільшення збільшення та роздільної здатності.

Електрони, як і електромагнітне випромінювання, можуть вести себе як хвилі, але при довжині хвиль 0,005 нм вони можуть виробляти набагато кращу роздільну здатність, ніж видиме світло. ЕМ може створювати різке зображення, яке збільшено до 100,000. Таким чином, ЕМС може розсмоктувати субклітинні структури, а також деякі молекулярні структури (наприклад, окремі нитки ДНК); однак електронна мікроскопія не може бути використана на живому матеріалі через методи, необхідні для підготовки зразків.

Існує два основних типи ЕМ: просвічувальний електронний мікроскоп (ТЕМ) і скануючий електронний мікроскоп (SEM) (рис. \(\PageIndex\) ). ТЕМ кілька аналогічний світловому мікроскопу яскравого поля в плані того, як він функціонує. Однак він використовує електронний промінь зверху зразка, який фокусується за допомогою магнітної лінзи (а не скляної лінзи) і проектується через зразок на детектор. Електрони проходять крізь зразок, а потім детектор захоплює зображення (рис. \(\PageIndex\) ).

Малюнок \(\PageIndex\) : (а) Просвічувальний електронний мікроскоп (ТЕМ). (б) скануючий електронний мікроскоп (SEM). (кредит a: модифікація роботи «Деші» /Wikimedia Commons; кредит b: модифікація роботи «Мікроскопія ZEISS» /Flickr) Малюнок \(\PageIndex\) : Електронні мікроскопи використовують магніти для фокусування електронних пучків аналогічно тому, як світлові мікроскопи використовують лінзи для фокусування світла.

Щоб електрони проходили через зразок у ТЕМ, зразок повинен бути надзвичайно тонким (товщиною 20-100 нм). Зображення створюється через різну непрозорість у різних частинок зразка. Цю непрозорість можна посилити, фарбуючи зразок такими матеріалами, як важкі метали, які мають електронну щільність. TEM вимагає, щоб промінь і зразок знаходилися у вакуумі і щоб зразок був дуже тонким і зневодненим. Конкретні кроки, необхідні для підготовки зразка до спостереження під ЕМ, детально розглянуті в наступному розділі.

СЕМ утворюють зображення поверхонь зразків, як правило, з електронів, які збиваються з зразків пучком електронів. Це дозволяє створювати високодеталізовані зображення з тривимірним виглядом, які відображаються на моніторі (рис. \(\PageIndex\) ). Як правило, зразки сушать та готують із фіксаторами, які зменшують артефакти, такі як зморщування, які можуть бути отримані шляхом сушіння, перш ніж покрити напиленням тонким шаром металу, такого як золото. У той час як трансмісійна електронна мікроскопія вимагає дуже тонких ділянок і дозволяє побачити внутрішні структури, такі як органели та внутрішню частину мембран, скануюча електронна мікроскопія може бути використана для перегляду поверхонь великих об’єктів (наприклад, пилкового зерна), а також поверхні дуже малих зразків ( Малюнок \(\PageIndex\) ). Деякі EMS можуть збільшити зображення до 2,000,000. 1

Малюнок \(\PageIndex\) : Ці схематичні ілюстрації порівнюють компоненти просвічувальних електронних мікроскопів та скануючих електронних мікроскопів. Рисунок \(\PageIndex\) : (а) Це TEM зображення клітин у біоплівці показує чітко визначені внутрішні структури клітин через різний рівень непрозорості зразка. (б) Це покращене кольором зображення SEM бактерії Staphylococcus aureus ілюструє здатність скануючої електронної мікроскопії візуалізувати тривимірні зображення поверхневої структури клітин. (кредит a: модифікація роботи Американського товариства мікробіології; кредит b: модифікація роботи Центрів контролю та профілактики захворювань)

1. Які переваги та недоліки електронної мікроскопії, на відміну від світлової мікроскопії, для дослідження мікробіологічних зразків?
2. Які види зразків найкраще досліджувати за допомогою ТЕА? СЕМ?

Використання мікроскопії для вивчення біоплівок

Біоплівка – це складне співтовариство одного або декількох видів мікроорганізмів, як правило, утворюється у вигляді слизового покриття, прикріпленого до поверхні через виробництво екстраполімерної речовини (EPS), яка прикріплюється до поверхні або на межі розділу між поверхнями (наприклад, між повітрям і водою). У природі біоплівки рясні і часто займають складні ніші всередині екосистем (рис. \(\PageIndex\) ). У медицині біоплівки можуть покривати медичні прилади і існувати в організмі. Оскільки вони мають унікальні характеристики, такі як підвищена стійкість до імунної системи та до протимікробних препаратів, біоплівки представляють особливий інтерес як для мікробіологів, так і для клініцистів.

Оскільки біоплівки товсті, їх не можна дуже добре спостерігати за допомогою світлової мікроскопії; нарізка біоплівки для створення більш тонкого зразка може вбити або порушити мікробну спільноту. Конфокальна мікроскопія забезпечує чіткіші зображення біоплівок, оскільки вона може фокусуватися на одній z-площині одночасно і виробляти тривимірне зображення товстого зразка. Флуоресцентні барвники можуть бути корисними для ідентифікації клітин в матриці. Крім того, можуть бути використані такі методи, як імунофлюоресценція і флуоресценція in situ гібридизація (FISH), в яких флуоресцентні зонди використовуються для зв’язування з ДНК.

Електронна мікроскопія може бути використана для спостереження за біоплівками, але тільки після зневоднення зразка, який виробляє небажані артефакти і спотворює зразок. На додаток до цих підходів, можна стежити за водними потоками через форми (наприклад, конуси та гриби) біоплівок, використовуючи відео руху флуоресцентно покритих намистин (рис. \(\PageIndex\) ).

Малюнок \(\PageIndex\) : Біоплівка утворюється, коли планктонні (вільно плаваючі) бактерії одного або декількох видів прилипають до поверхні, виробляють слиз і утворюють колонію. (кредит: Публічна бібліотека науки). Малюнок \(\PageIndex\) : На цьому зображенні кілька видів бактерій ростуть у біоплівці на нержавіючої сталі (забарвлені DAPI для епіфлуоресцентної міскопії). (кредит: Рікардо Мурга, Родні Донлан).

Скануюча зондова мікроскопія

Скануючий зондовий мікроскоп використовує не світло або електрони, а досить дуже гострі зонди, які пропускаються по поверхні зразка і взаємодіють з ним безпосередньо. Це дає інформацію, яка може бути зібрана в зображення зі збільшенням до 100,000,000. Такі великі збільшення можна використовувати для спостереження окремих атомів на поверхнях. На сьогоднішній день ці методики використовуються в першу чергу для досліджень, а не для діагностики.

Існує два типи скануючого зондового мікроскопа: скануючий тунельний мікроскоп (STM) і атомно-силовий мікроскоп (AFM). STM використовує зонд, який пропускається трохи вище зразка, оскільки зміщення постійної напруги створює потенціал для електричного струму між зондом та зразком. Цей струм відбувається за допомогою квантового тунелювання електронів між зондом і зразком, а інтенсивність струму залежить від відстані між зондом і зразком. Зонд переміщають горизонтально над поверхнею і вимірюють інтенсивність струму. Скануюча тунельна мікроскопія може ефективно відображати структуру поверхонь з роздільною здатністю, при якій можуть бути виявлені окремі атоми.

Подібно до STM, AFM мають тонкий зонд, який пропускається трохи вище зразка. Однак замість того, щоб вимірювати зміни струму на постійній висоті над зразком, AFM встановлює постійний струм і вимірює зміни висоти наконечника зонда при проходженні над зразком. Коли наконечник зонда передається над зразком, сили між атомами (сили ван дер Ваальса, капілярні сили, хімічний зв’язок, електростатичні сили та інші) змушують його рухатися вгору і вниз. Прогин наконечника зонда визначається і вимірюється за законом пружності Гука, і ця інформація використовується для побудови зображень поверхні зразка з роздільною здатністю на атомному рівні (рис. \(\PageIndex\) ).

Малюнок \(\PageIndex\) : STM і AFM дозволяють переглядати зображення на атомному рівні. (a) Це зображення STM чистої поверхні золота показує окремі атоми золота, розташовані в колони. (b) Це зображення AFM показує довгі, схожі на нитки молекули наноцелюлози, створеної лабораторією речовини, отриманої з рослинних волокон. (кредит a: модифікація роботи «Ервінроссена» /Вікісховища).

1. Який має більш високе збільшення, світловий мікроскоп або скануючий зондовий мікроскоп?
2. Назвіть одну перевагу і одне обмеження скануючої зондової мікроскопії.

Малюнок \(\PageIndex<17>\) : (кредит «Brightfield»: модифікація роботи Американського товариства мікробіології; кредит «Darkfield»: модифікація роботи Американського товариства мікробіології; кредит «Фазовий контраст»: модифікація роботи Американського товариства мікробіології; кредит «DIC»: модифікація роботи американським Товариство мікробіології; кредит «Флуоресценція»: модифікація роботи Американського товариства мікробіології; кредит «Конфокальний»: модифікація роботи Американського товариства мікробіології; кредит «Двофотон»: модифікація роботи Альберто Діаспро, Паоло Бьянчіні, Джузеппе Вічідоміні, Маріо Фаретта, Паола Рамоіно , Чезаре Усай). Малюнок \(\PageIndex\) : (Кредит «TEM»: модифікація роботи Американського товариства мікробіології; кредит «SEM»: модифікація роботи Американського товариства мікробіології) Малюнок \(\PageIndex\) : Методи мікроскопії для сканування зондових мікроскопів.

Ключові поняття та резюме

• Численні типи мікроскопів використовують різні технології для створення мікрознімків. Більшість з них корисні для конкретного типу зразка або застосування.
• Світлова мікроскопія використовує лінзи для фокусування світла на зразку для отримання зображення. Зазвичай використовувані світлові мікроскопи включають яскраве поле, темне поле, фазовий контраст, диференціальний інтерференційний контраст, флуоресценцію, конфокальні та двофотонні мікроскопи.
• Електронна мікроскопія фокусує електрони на зразку за допомогою магнітів, виробляючи набагато більше збільшення, ніж світлова мікроскопія. Просвічувальний електронний мікроскоп (ТЕМ) та скануючий електронний мікроскоп (SEM) є двома поширеними формами.
• Скануюча зондова мікроскопія створює зображення ще більшого збільшення шляхом вимірювання зворотного зв’язку від гострих зондів, які взаємодіють зі зразком. Зондові мікроскопи включають скануючий тунельний мікроскоп (STM) і атомно-силовий мікроскоп (AFM).

Виноски

1. 1 «JEM-ARM200F Трансмісійний електронний мікроскоп,» JEOL США Inc, www.jeolusa.com/продукти/Tran. специфікації. Доступно 28.08.2015.

Глосарій

атомний силовий мікроскоп скануючий зонд-мікроскоп, який використовує тонкий зонд, який передається трохи вище зразка для вимірювання сил між атомами і зондом бінокулярний мають два окуляра яскравий польовий мікроскоп складний світловий мікроскоп з двома лінзами; він виробляє темне зображення на яскравому тлі груба ручка фокусування ручка на мікроскопі, який виробляє відносно великі рухи для регулювання фокусування хромофори пігменти, які поглинають і відображають певні довжини хвиль світла (надаючи їм колір) об’єктив конденсатора об’єктив на мікроскоп, який фокусує світло від джерела світла на зразок конфокальний мікроскоп скануючий лазерний мікроскоп, який використовує флуоресцентні барвники та лазери збудження для створення тривимірних мікроскоп темного поля з’єднання світла мікроскоп, який виробляє яскраве зображення на темному тлі; як правило, модифікований яскраве поле мікроскоп діафрагми компонент мікроскопа; зазвичай складається з диска під сценою з отворами різних розмірів; можна регулювати, щоб дозволити більш-менш світла від джерела світла, щоб досягти зразка диференціальний інтерференційно-контрастний мікроскоп мікроскоп, який використовує поляризоване світло для збільшення контрасту електронний мікроскоп тип мікроскопа, який використовує короткохвильові електронні пучки, а не світло для збільшення збільшення та роздільної здатності тонка ручка фокусування ручка на мікроскопі, який виробляє відносно невеликі рухи для регулювання фокусування флуоресцентний мікроскоп мікроскоп, який використовує природні флюорохроми або флуоресцентні плями для збільшення контрасту фторохроми хромофори, які флуоресцентні (поглинають, а потім випромінюють світло) освітлювач джерело світла на мікроскопі імунофлюоресценції метод, який використовує флуоресцентний мікроскоп і антитіло-специфічних флюорохромів для визначення наявності специфічних патогенів у зразку монокуляр маючи єдиний окуляр об’єктивні лінзи на світловому мікроскопі лінзи, найближчі до зразка, зазвичай розташовані на кінцях башточок очна лінза на мікроскопі лінза, найближча до ока (також називається окуляром) масло занурення лінзи спеціальна об’єктивна лінза на мікроскопі, призначена для використання з іммерсійним маслом для поліпшення роздільної здатності фазово-контрастний мікроскоп світло мікроскоп, який використовує кільцевої зупинки і кільцевої пластини для збільшення контрасту реостат перемикач диммера, який контролює інтенсивність освітлювача на світловому мікроскопі скануючий електронний мікроскоп (SEM) тип електронний мікроскоп, який відскакує електронів від зразка, утворюючи зображення поверхні скануючий зондовий мікроскоп мікроскоп, який використовує зонд, який подорожує по поверхні зразка на постійній відстані в той час як струм, який чутливий до розміру зазору, вимірюється скануючий тунельний мікроскоп мікроскоп, який використовує зонд, який передається трохи вище зразка, як зміщення постійної напруги створює потенціал для електричного струму між зондом і зразком етап платформа мікроскопа, на якій розміщені слайди загальне збільшення в світловому мікроскопі – величина, розрахована шляхом множення збільшення ока на збільшення об’єктивів просвічувальний електронний мікроскоп (ТЕМ) тип електронний мікроскоп, який використовує електронний промінь, сфокусовані з магнітами, що проходить через тонкий зразок двофотонний мікроскоп мікроскоп, який використовує довгохвильовий або інфрачервоне світло для флуоресценції флюорохромів у зразку x-y механічні ручки ступені ручки на мікроскопі, які використовуються для регулювання положення зразка на поверхні сцени, як правило, для центрування його безпосередньо над світлом

Recommended articles

1. Article type Section or Page License CC BY License Version 4.0 Show Page TOC No on Page
2. Tags
   1. atomic force microscope
   2. authorname:openstax
   3. binocular
   4. brightfield microscope
   5. chromophores
   6. coarse focusing knob
   7. condenser lens
   8. confocal microscope
   9. darkfield microscope
   10. diaphragm
   11. differential interference-contrast microscope
   12. electron microscope
   13. fine focusing knob
   14. fluorescence microscope
   15. fluorochromes
   16. illuminator
   17. Immunofluorescence
   18. monocular
   19. objective lenses
   20. ocular lens
   21. oil immersion lens
   22. phase-contrast microscope
   23. rheostat
   24. scanning electron microscope
   25. scanning electron microscope (SEM)
   26. scanning probe microscope
   27. scanning tunneling microscope
   28. SEM
   29. source@https://openstax.org/details/books/microbiology
   30. source[translate]-bio-5280
   31. stage
   32. TEM
   33. total magnification
   34. transmission electron microscope
   35. transmission electron microscope (TEM)
   36. two-photon microscope
   37. x-y mechanical stage knobs

   2.1: Властивості світла

   Сінді, 17-річна порадниця літнього спортивного табору, зішкребла коліно, граючи в баскетбол 2 тижні тому. У той час вона думала, що це лише незначне стирання, яке заживе, як і багато інших до цього. Натомість рана почала виглядати як укус комахи і продовжувала ставати все більш болючою і набряклою.

   Таборна медсестра оглядає ураження і спостерігає велику кількість гною, що сочиться з поверхні. Стурбована тим, що у Сінді, можливо, розвинулася потенційно агресивна інфекція, вона мазати рану, щоб зібрати зразок з місця інфекції. Потім вона очищає гній і одягає рану, доручаючи Сінді тримати область чистою і повернутися на наступний день. Коли Сінді йде, медсестра відправляє зразок до найближчої медичної лабораторії для аналізу під мікроскопом.

   Які речі ми можемо дізнатися про ці бактерії, подивившись на них під мікроскопом?

   Видиме світло складається з електромагнітних хвиль, які поводяться як інші хвилі. Отже, багато властивостей світла, які мають відношення до мікроскопії, можна зрозуміти з точки зору поведінки світла як хвилі. Важливою властивістю світлових хвиль є довжина хвилі, або відстань між одним піком хвилі і наступним піком. Висота кожного піка (або глибина кожного жолоба) називається амплітудою. На відміну від цього, частота хвилі – це швидкість вібрації хвилі, або кількість довжин хвиль протягом заданого періоду часу (рис. \(\PageIndex\) ).

   Малюнок \(\PageIndex\) : (а) Амплітуда – це висота хвилі, тоді як довжина хвилі – це відстань між одним піком і наступним. (б) Ці хвилі мають різні частоти або швидкості вібрації. Хвиля вгорі має найнижчу частоту, оскільки має найменшу кількість піків за одиницю часу. Хвиля внизу має найвищу частоту.

   Взаємодія Світла

   Світлові хвилі взаємодіють з матеріалами, відбиваючись, поглинаючись або передаючись. Відображення відбувається, коли хвиля відскакує від матеріалу. Наприклад, червоний шматок тканини може відображати червоне світло для наших очей, поглинаючи інші кольори світла. Поглинання відбувається, коли матеріал захоплює енергію світлової хвилі. У випадку з пластиками, що світяться в темряві, енергія світла може бути поглинена, а потім повторно випромінюватися як інша форма фосфоресценції. Передача відбувається, коли хвиля проходить через матеріал, як світло через скло (процес передачі називається пропусканням). Коли матеріал дозволяє пропускати велику частку світла, він може зробити це, оскільки він тонший або більш прозорий (має більшу прозорість та меншу непрозорість). Малюнок \(\PageIndex\) ілюструє різницю між прозорістю і непрозорістю.

   Малюнок \(\PageIndex\) : (а) Чашка Петрі виготовлена з прозорого пластику або скла, що дозволяє пропускати велику частку світла. Ця прозорість дозволяє нам бачити через боки страви, щоб переглянути вміст. (b) Цей шматочок залізного метеорита непрозорий (тобто він має непрозорість). Світло не передається через матеріал, що робить неможливим побачити частину руки, покриту предметом. (Кредит а: модифікація роботи Умберто Сальвагнін; кредит б: модифікація роботи «Waifer X» /Flickr)

   Світлові хвилі також можуть взаємодіяти між собою за допомогою перешкод, створюючи складні закономірності руху. Скидання двох камінчиків в калюжу змушує хвилі на поверхні калюжі взаємодіяти, створюючи складні інтерференційні візерунки. Світлові хвилі можуть взаємодіяти таким же чином.

   Крім того, що заважають один одному, світлові хвилі також можуть взаємодіяти з дрібними предметами або отворами шляхом згинання або розсіювання. Це називається дифракцією. Дифракція більша, коли об’єкт менше по відношенню до довжини хвилі світла (відстань між двома послідовними піками світлової хвилі). Часто, коли хвилі дифрактують в різні боки навколо перешкоди або отвору, вони будуть заважати один одному.

   1. Якщо світлова хвиля має довгу довжину хвилі, чи може вона мати низьку або високу частоту?
   2. Якщо об’єкт прозорий, він відображає, поглинає чи пропускає світло?

   Лінзи і заломлення

   У контексті мікроскопії заломлення є, мабуть, найважливішою поведінкою, що проявляється світловими хвилями. Заломлення відбувається, коли світлові хвилі змінюють напрямок, коли вони потрапляють в нове середовище (рис. \(\PageIndex\) ). Різні прозорі матеріали пропускають світло з різною швидкістю; таким чином, світло може змінювати швидкість при переході від одного матеріалу до іншого. Ця зміна швидкості зазвичай також викликає зміну напрямку (заломлення), при цьому ступінь зміни залежить від кута вхідного світла.

   Малюнок \(\PageIndex\) : (а) Заломлення відбувається, коли світло переходить від одного середовища, наприклад повітря, до іншого, наприклад скла, змінюючи напрямок світлових променів. (b) Як показано на цій діаграмі, світлові промені, що проходять від одного середовища до іншого, можуть бути або заломлені, або відбиті. (кредит a: модифікація роботи «аджизай» /Вікісховище).

   Ступінь, в якій матеріал уповільнює швидкість передачі щодо порожнього простору, називається показником заломлення цього матеріалу. Великі відмінності між показниками заломлення двох матеріалів призведуть до великої кількості заломлення при переході світла з одного матеріалу в інший. Наприклад, світло рухається набагато повільніше через воду, ніж через повітря, тому світло, що надходить у воду з повітря, може сильно змінити напрямок. Ми говоримо, що вода має більш високий показник заломлення, ніж повітря (рис. \(\PageIndex\) ).

   Малюнок \(\PageIndex\) : Цей прямий полюс, здається, згинається під кутом, коли він входить у воду. Така оптична ілюзія обумовлена великою різницею між показниками заломлення повітря і води.

   Коли світло перетинає межу в матеріал з більш високим показником заломлення, його напрямок повертається ближче до перпендикулярно до межі (тобто більше до нормалі до цієї межі; рис. \(\PageIndex\) ). Це принцип, що лежить в основі лінз. Ми можемо думати про лінзу як про об’єкт із вигнутою межею (або сукупністю призм), який збирає все світло, що вражає його, і заломлює його так, що все зустрічається в одній точці, яка називається точкою зображення (фокус). Опукла лінза може бути використана для збільшення, оскільки вона може фокусуватися на ближчому діапазоні, ніж людське око, створюючи більше зображення. Увігнуті лінзи та дзеркала також можуть використовуватися в мікроскопах для перенаправлення світлового шляху. \(\PageIndex\) На малюнку показана фокусна точка (точка зображення при попаданні світла в об’єктив паралельна) і фокусна відстань (відстань до фокусної точки) для опуклих і увігнутих лінз.

   Малюнок \(\PageIndex\) : (а) Лінза схожа на колекцію призм, наприклад, показану тут. (b) Коли світло проходить через опуклу лінзу, воно заломлюється до фокусної точки на іншій стороні лінзи. Фокусна відстань – це відстань до фокусної точки. (c) Світло, що проходить через увігнуту лінзу, заломлюється від фокусної точки перед лінзою.

   Людське око містить лінзу, яка дозволяє нам бачити зображення. Ця лінза фокусує світло, що відбивається від предметів перед оком, на поверхню сітківки, яка схожа на екран в задній частині ока. Штучні лінзи, розміщені перед оком (контактні лінзи, окуляри або мікроскопічні лінзи), фокусують світло перед тим, як воно буде сфокусовано (знову) лінзою ока, маніпулюючи зображенням, яке потрапляє на сітківку (наприклад, роблячи його більшим).

   Зображення зазвичай маніпулюють, контролюючи відстані між об’єктом, об’єктивом та екраном, а також кривизною об’єктива. Наприклад, при заданій величині кривизни, коли об’єкт знаходиться ближче до лінзи, фокусні точки знаходяться далі від лінзи. Як результат, часто доводиться маніпулювати цими відстанями, щоб створити сфокусоване зображення на екрані. Аналогічно, більша кривизна створює точки зображення ближче до об’єктива і більше зображення, коли зображення знаходиться у фокусі. Ця властивість часто описується з точки зору фокусної відстані, або відстані до фокусної точки.

   1. Поясніть, як лінза фокусує світло в точці зображення.
   2. Назвіть деякі фактори, що впливають на фокусну відстань лінзи.

   Електромагнітний спектр і колір

   Видиме світло – це лише одна форма електромагнітного випромінювання (ЕМР), тип енергії, яка навколо нас. Інші форми EMR включають мікрохвильові печі, рентгенівські промені та радіохвилі, серед інших. Різні типи ЕМР потрапляють на електромагнітний спектр, який визначається з точки зору довжини хвилі та частоти. Спектр видимого світла займає відносно невеликий діапазон частот між інфрачервоним і ультрафіолетовим світлом (рис. \(\PageIndex\) ).

   Малюнок \(\PageIndex\) : Електромагнітний спектр коливається від високочастотних гамма-променів до низькочастотних радіохвиль. Видиме світло – це відносно невеликий діапазон електромагнітних частот, які можна відчути людським оком. На електромагнітному спектрі видиме світло потрапляє між ультрафіолетовим і інфрачервоним світлом. (кредит: модифікація роботи Йоганнеса Альмана).

   Тоді як довжина хвилі являє собою відстань між сусідніми піками світлової хвилі, частота, в спрощеному визначенні, являє швидкість коливань. Хвилі з більш високими частотами мають менші довжини хвиль і, отже, мають більше коливань в одиницю часу, ніж хвилі низької частоти. Хвилі більш високої частоти також містять більше енергії, ніж хвилі низької частоти. Ця енергія доставляється у вигляді елементарних частинок, званих фотонами. Високочастотні хвилі доставляють більше енергійних фотонів, ніж низькочастотні хвилі.

   Фотони з різною енергією по-різному взаємодіють з сітківкою. У спектрі видимого світла кожен колір відповідає певній частоті та довжині хвилі (рис. \(\PageIndex\) ). Найнижча частота видимого світла виглядає як червоний колір, тоді як найвищий – як фіолетовий колір. Коли сітківка отримує видиме світло багатьох різних частот, ми сприймаємо це як біле світло. Однак біле світло можна розділити на складові кольори за допомогою заломлення. Якщо ми пропустимо біле світло крізь призму, різні кольори будуть заломлюватися в різні боки, створюючи райдужний спектр на екрані за призмою. Таке поділ кольорів називається дисперсією, і відбувається воно тому, що для даного матеріалу показник заломлення різний для різних частот світла.

   Певні матеріали можуть заломлювати невидимі форми ЕМР і, по суті, перетворювати їх у видиме світло. Деякі флуоресцентні барвники, наприклад, поглинають ультрафіолетове або синє світло, а потім використовують енергію для випромінювання фотонів іншого кольору, віддаючи світло, а не просто вібрацію. Це відбувається тому, що поглинання енергії змушує електрони стрибати до вищих енергетичних станів, після чого вони майже відразу ж падають назад до своїх наземних станів, випромінюючи певну кількість енергії у вигляді фотонів. Не вся енергія випромінюється в даному фотоні, тому випромінювані фотони будуть меншої енергії і, таким чином, меншої частоти, ніж поглинені. Таким чином, такий барвник, як Техаський червоний, може збуджуватися синім світлом, але випромінювати червоне світло; або такий барвник, як ізотіоціанат флуоресцеїну (FITC), може поглинати (невидимий) високоенергетичний ультрафіолетове світло і випромінювати зелене світло (рис. \(\PageIndex\) ). У деяких матеріалах фотони можуть виділятися після затримки після поглинання; в цьому випадку процес називається фосфоресценцією. Пластик, що світиться в темряві, працює за допомогою фосфоресцентного матеріалу.

   Рисунок \(\PageIndex\) : Флуоресцентні барвники, поглинені цими ендотеліальними клітинами легеневої артерії великої рогатої худоби, випромінюють блискучі кольори при збудженні ультрафіолетовим світлом під Різні клітинні структури поглинають різні барвники. Ядра пофарбовані в синій колір з 4′,6-діамідіно-2-феніліндолом (DAPI); мікротрубки позначені зеленим кольором антитілом, пов’язаним з FITC; а актинові нитки позначені червоним кольором з фаллоїдином, пов’язаним з тетраметилродаміном (TRITC).

   1. Який має більш високу частоту: червоне світло або зелене світло?
   2. Поясніть, чому дисперсія виникає при проходженні білого світла через призму.
   3. Чому флуоресцентні барвники випромінюють інший колір світла, ніж вони поглинають?

   Збільшення, роздільна здатність і контрастність

   Мікроскопи збільшують зображення і використовують властивості світла для створення корисних зображень дрібних об’єктів. Збільшення визначається як здатність об’єктива збільшувати зображення об’єкта в порівнянні з реальним об’єктом. Наприклад, збільшення 10означає, що зображення з’являється в 10 разів більше розміру об’єкта, як видно неозброєним оком.

   Більше збільшення, як правило, покращує нашу здатність бачити деталі дрібних об’єктів, але лише збільшення недостатньо, щоб зробити найбільш корисні зображення. Часто корисно посилити роздільну здатність об’єктів: вміння сказати, що дві окремі точки або об’єкти є окремими. Зображення з низькою роздільною здатністю виглядає нечітким, тоді як зображення з високою роздільною здатністю виглядає різким. Два фактори впливають на роздільну здатність. Перший – довжина хвилі. Більш короткі довжини хвиль здатні вирішувати менші об’єкти; таким чином, електронний мікроскоп має набагато більшу роздільну здатність, ніж світловий мікроскоп, оскільки він використовує електронний промінь з дуже короткою довжиною хвилі, на відміну від довгохвильового видимого світла, що використовується світловим мікроскопом. Другий фактор, який впливає на роздільну здатність, – це числова діафрагма, яка є мірою здатності об’єктива збирати світло. Чим вище числова діафрагма, тим краще дозвіл.

   Навіть коли мікроскоп має високу роздільну здатність, у багатьох зразках може бути важко відрізнити невеликі структури, оскільки мікроорганізми відносно прозорі. Часто необхідно збільшити контраст для виявлення різних структур у зразку. Різні типи мікроскопів використовують різні особливості світла або електронів для збільшення контрастності видимих відмінностей між частинами зразка (див. Інструменти мікроскопії). Крім того, барвники, які зв’язуються з деякими структурами, але не інші, можуть бути використані для поліпшення контрасту між зображеннями відносно прозорих об’єктів (див. Фарбування мікроскопічних зразків).

   1. Поясніть різницю між збільшенням і роздільною здатністю.
   2. Поясніть різницю між роздільною здатністю і контрастністю.
   3. Назвіть два фактори, що впливають на роздільну здатність.

   Ключові поняття та резюме

   • Світлові хвилі, що взаємодіють з матеріалами, можуть відбиватися, поглинатися або передаватися в залежності від властивостей матеріалу.
   • Світлові хвилі можуть взаємодіяти один з одним (інтерференція) або спотворюватися взаємодіями з дрібними предметами або отворами (дифракція).
   • Заломлення відбувається, коли світлові хвилі змінюють швидкість і напрямок при переході від одного середовища до іншого. Відмінності показників заломлення двох матеріалів визначають величину спрямованих змін при переході світла від одного до іншого.
   • Лінза – це середовище з вигнутою поверхнею, яка заломлює і фокусує світло для отримання зображення.
   • Видиме світло є частиною електромагнітного спектра; світлові хвилі різної частоти і довжини хвиль розрізняються людським оком як кольори.
   • Призма може розділяти кольори білого світла (дисперсії), оскільки різні частоти світла мають різні показники заломлення для даного матеріалу.
   • Флуоресцентні барвники та фосфоресцентні матеріали можуть ефективно перетворювати невидиме електромагнітне випромінювання у видиме світло.
   • Потужність мікроскопа може бути описана з точки зору його збільшення і дозволу.
   • Дозвіл можна збільшити за рахунок скорочення довжини хвилі, збільшення числової діафрагми об’єктива або використання плям, що підсилюють контраст.

   Глосарій

   поглинання коли молекула захоплює енергію від фотона і вібрує або розтягується, використовуючи енергію амплітуда висота хвилі контраст видимі відмінності між частинами мікроскопічного зразка дифракція зміна напрямку (згинання або поширення), що відбувається при взаємодії світлової хвилі з отвором або бар’єром дисперсія поділ світла різної частоти за рахунок різного ступеня заломлення флуоресцентний здатність певних матеріалів поглинати енергію, а потім негайно звільнити цю енергію у вигляді світла фокусна відстань відстань від об’єктива до точки зображення, коли об’єкт знаходиться на певній відстані від об’єктива (це також відстань до фокусної точки) фокусна точка властивість лінзи; точка зображення при попаданні світла в об’єктив паралельна (тобто об’єкт знаходиться на нескінченній відстані від об’єктива) частоти швидкість вібрації для світлової хвилі або іншої електромагнітної хвилі точка зображення (фокус) властивість об’єктива і відстань об’єкта до об’єктива; точка, в якій зображення знаходиться у фокусі (точка зображення часто називають фокусом) втручання спотворення світлової хвилі внаслідок взаємодії з іншою хвилею збільшення потужність мікроскопа (або об’єктива) для отримання зображення, яке здається більшим, ніж фактичний зразок, виражений як фактор фактичного розміру числова апертура міра здатність об’єктива збирати світло непрозорість властивість поглинати або блокувати світло фосфоресценції здатність певних матеріалів поглинати енергію, а потім вивільнити цю енергію як світло після затримки відображення коли світло відскакує назад від поверхні заломлення вигин світлових хвиль, що виникає при переході світлової хвилі з одного середовища в іншу показник заломлення міра величини уповільнення світлових хвиль певним середовищем резолюція здатність розрізняти дві точки на зображенні пропускання кількість світла, яке проходить через середовище прозорість властивість пропускати світло довжина хвилі відстань між одним піком хвилі і наступним піком

   Recommended articles

   1. Article type Section or Page License CC BY License Version 4.0 Show Page TOC No on Page
   2. Tags
      1. absorbance
      2. amplitude
      3. authorname:openstax
      4. Contrast
      5. diffraction
      6. Dispersion
      7. fluorescent
      8. focal length
      9. focal point
      10. frequency
      11. image point
      12. image point (focus)
      13. interference
      14. Magnification
      15. numerical aperture
      16. opacity
      17. phosphorescence
      18. Reflection
      19. refraction
      20. Refractive index
      21. resolution
      22. source@https://openstax.org/details/books/microbiology
      23. source[translate]-bio-5278
      24. transmittance
      25. transparency
      26. wavelength